刃针疗法对膝骨关节炎白兔膝关节软骨组织黏着(2)

1.5.4 电针组：造模成功后1 d，根据比较解剖取穴法结合模拟骨度取穴法[5]，参照《实验针灸学》[6]取阴陵泉、阳陵泉、内外膝眼穴位，采用神经刺激仪进行电针刺激，频率2/100 Hz，强度3 mA，20 min/次。隔日治疗1次，1周3次，共治疗2周。

1.5.5 抑制组：刃针抑制组和电针抑制组均在每次治疗前的2 h内给予关节腔注射抑制剂PF-(200 μmol/L，0.5 mL)，其余操作与对应非抑制组(刃针组或电针组)相同。模型抑制组的抑制剂使用与上述同步进行。隔日治疗1次，1周3次，共治疗2周。

1.6 观察指标检测方法

1.6.1 标本收集：各组干预结束后，采用10%水合氯醛按照2 mL/kg进行耳缘静脉注射，麻醉后处死所有白兔，打开白兔的右下肢膝关节腔，剔除周围韧带、滑膜、半月板等组织，分别用咬骨钳在股骨髁以及胫骨平台负重软骨面迅速取出大约1cm×1cm的软骨-骨标本，用磷酸缓冲盐溶液冲洗组织块上的血液、黏液、污物等，置于液氮中速冻，然后置于-80℃冰箱冻存待检。

1.6.2 光镜观察：取空白组和模型组的膝关节软骨标本，放入乙二胺四乙酸脱钙液依次进行脱水、透明、脱蜡，然后进行石蜡包埋，切片厚度6 μm；采用苏木精-伊红染色法，光镜下观察兔膝关节软骨情况。

1.6.3 蛋白免疫印迹分析：采用蛋白免疫印迹法检测各组的膝关节软骨组织整合素β1、FAK、ERK1/2、p38、JNK蛋白表达水平。取膝关节软骨组织，采用细胞裂解法提取总蛋白，采用二喹啉甲酸法蛋白浓度测定试剂盒检验蛋白浓度后行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，浓缩胶恒压80 V，约20 min，分离胶恒压160 V。电泳结束后，于硝酸纤维素膜转移电泳槽以恒流200 mA转膜 2 h，聚偏二氟乙烯膜在5%的脱脂牛奶，37℃恒温中封闭2 h；洗膜后分别加整合素β1、FAK、p38、ERK1/2、JNK(1 ∶500稀释)，4℃孵育过夜；PBST漂洗滤膜4次，5 min/次；加辣根过氧化物酶标记的二抗(1 ∶5 000稀释)，37℃孵育2 h，PBST 漂洗滤膜4次，5 min/次；按0.1 mL/cm2显影液计算用量，将显影液加在聚偏二氟乙烯膜上，室温放置1 min，用保鲜膜包好。暗室中迅速将聚偏二氟乙烯膜蛋白贴在X光胶片上曝光，洗片机中显影、洗像，然后采用Image J 软件定量分析各目标蛋白值，实验重复3次，取平均值。

1.7 统计学分析 采用SPSS 19.0软件进行统计分析。其中计量资料若数据呈正态分布则采用(x±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析；若数据不符合方差齐性，则采用Tamhane′s T2方法检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 动物行为及光镜下形态学的观察结果 造模后的白兔患肢均有所收缩，活动明显减少，且伴轻度全身反应症状(如周身颤抖、回头、乱窜、挣扎)，轻度跛行，但蹬地有力。光镜下观察发现，空白组白兔的膝关节骨层次(例如表浅层、移行层、辐射层、钙化层等)完整，而模型组白兔膝关节骨层次紊乱不清，且存在分层剥脱、细胞弥漫性增生、细胞簇集，见图1。

图1 空白组与模型组白兔膝关节的病理学表现(苏木精-伊红染色，×100倍)

2.2 7组兔膝关节软骨整合素β1、FAK、p38、JNK及ERK1/2蛋白表达水平比较 与空白组对比，模型组整合素β1、FAK、p38、JNK及ERK1/2蛋白表达水平均升高(均P<0.05)。与模型组比较，刃针组、电针组的整合素β1、FAK、p38、JNK及ERK1/2蛋白表达水平均降低(均P<0.05)。与电针组对比，刃针组整合素β1、JNK及ERK1/2蛋白表达水平降低(均P<0.05)，而两组FAK、p38表达水平比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。与对应干预方法组比较，使用抑制剂的各组整合素β1、FAK、p38、JNK及ERK1/2蛋白表达水平下降(均P<0.05)。

表1 7组白兔膝关节软骨相关蛋白相对表达水平比较(x±s)组别n整合素β1FAKp38JNKERK1/2空白组80.模型组82.? 2.?2.?2.?6.?模型抑制组82.# 1.#2.#2.#6.#刃针组81.#1.#1.#1.#5.#刃针抑制组81.▲ 0.▲1.▲ 1.▲4.▲电针组81.#▲1.#1.#2.#▲5.#▲电针抑制组81.●0.●1.● 1.●5.● F值12.....759P值<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

3 讨 论

目前，临床上对早、中期KOA患者多采用保守治疗，晚期则趋向于人工关节置换术。“经筋理论”认为，KOA属“经筋痹”，以经筋所属筋肉、关节为主，治疗上应该以理筋活络、解结消散为原则[7]。但由于缺乏传统中医理论指导治疗KOA的分子生物学机制研究，以及现代医学认可的证据，导致其在医学界的推广应用受到阻碍。探讨中医理论指导治疗KOA的分子生物学机制具有重要意义。刃针疗法是在小针刀基础上发展而来的一种更安全的微创疗法，能较好地调节膝骨关节面的力学分布，恢复关节动静力平衡，降低肌肉、筋膜等软组织的异常张力，对软组织起到一种松懈作用。已有大量研究表明，“经筋理论”指导下使用针刀治疗KOA可取得很好的临床效果[8-11]。因此，本研究旨在探讨刃针干预促进KOA缓解的可能力学转导通路。

文章来源：《力学季刊》 网址: http://www.lxjkzz.cn/qikandaodu/2021/0208/337.html